前言：骨髓增生异常综合征（MDS）是由一系列突变的相继获得所导致的，因此其进展为急性髓系白血病（AML）的风险各不相同。CEBPA突变通常与疾病进展的高风险相关，但它们是否会导致AML的发生尚不清楚。为了分析疾病进展的分子基础，研究团队从一名携带RUNX1/SRSF2突变的低危男性患者中生成了MDS患者来源的诱导多能干细胞（iPSC），并发现突变型C/EBPα是导致MDS疾病进展的原因，为药物筛选提供了一个新的同基因MDS实验模型，以改善诊断和治疗策略。

大咖评述

一项英国主导的骨髓增生异常综合征（MDS）研究揭示了一个驱动疾病进展的关键基因突变。该伯明翰大学的研究人员旨在构建一种新的疾病细胞模型，通过将患者细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）来实现，研究证实，CEBPA基因的突变与MDS向急性髓系白血病（AML）的转化相关。此项研究发现已发表于《自然通讯》（Nature Communications）。

研究人员发现，该基因突变导致疾病侵袭性增强，表现为健康细胞数量减少且白细胞生成受阻。在实验室中对细胞进行化疗测试的结果表明，常规化疗难以有效抑制异常细胞的快速增殖。伯明翰大学名誉教授Constanze Bonifer解释道：“为验证这一发现，我们不仅分析了体外培养细胞的行为，还全面检测了细胞群体内每个基因的活性变化。实验显示，在原有突变背景基础上引入CEBPA突变，会改变血细胞中DNA的空间构象，从而彻底重塑基因表达谱，将细胞推向恶性转化途径。”

研究负责人Paloma Garcia博士强调：“利用iPSC构建疾病模型为理解血液肿瘤发生机制提供了全新视角，将极大加速新疗法的研发进程。CEBPA基因突变在疾病进展中关键作用的确认，标志着我们在开发MDS新型诊疗策略、预防其向更严重阶段转化方面迈出了重要一步。”

研究拓展

在衰老过程中，造血干细胞/祖细胞（HSPCs）会积累体细胞突变，导致意义未定的克隆性造血（CHIP），并引发诸如MDS等血液系统疾病。MDS是一组异质性的克隆性血液系统疾病，其特征为血细胞减少和造血功能受损，其中30%的患者最终会进展为AML。下一代测序（NGS）研究揭示了该疾病的克隆性：（i）MDS起始克隆含有在患者进展为AML时仍持续存在的突变；（ii）诸如DNMT3A、TET2、ASXL1、TP53和SF3B1等常见突变基因，对于疾病的起始至关重要。高危MDS患者通常接受去甲基化药物如阿扎胞苷的治疗，但超过半数的患者对该治疗无反应。由于从MDS患者中获取的细胞数量不足以及缺乏能够重现遗传突变和染色体改变谱系的动物模型系统，治疗失败和AML进展的原因尚未得到充分研究。将MDS细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）已被证明在识别关键疾病相关基因（如位于del(7q)的基因）方面具有极大价值；确定携带t(4;12)、SF3B1、EZH2和del5q突变的MDS患者克隆进化的突变顺序；以及构建MDS向AML进展且以NRAS为疾病进展驱动因素的克隆进化表型路线图。
 

然而，要了解导致克隆异质性、疾病进展和疾病表型高度变异的与疾病进展相关的其他常见突变的精确作用，仍需进一步研究。已知调控髓系分化的转录因子突变，特别是RUNX1和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）突变，在MDS向继发性AML的进展过程中较为常见。其中，CEBPA bZIP结构域的突变尤为引人关注，该结构域对于DNA结合和二聚化至关重要。bZIP结构域的突变大多为框内插入/缺失，而移码插入/缺失或导致提前翻译终止的无义突变则较为少见。事实上，目前的世界卫生组织（WHO）AML分类将C端CEBPAbZIP突变视为一种具有良好预后、总体生存率更高和复发风险更低的独立实体。大多数研究基于蛋白质N端转录激活结构域和bZIP C端结构域的突变。然而，CEBPA单突变中有三分之一发生在这两个区域之间。这些突变如何在MDS背景下影响bZIP结构域尚未得到探索，并且尽管它们与疾病进展相关，但它们在多大程度上会导致MDS疾病进展的高风险尚不清楚。
 

研究团队报告了从一名诊断为低危MDS且具有正常核型并携带SRSF2和RUNX1突变的患者中生成MDS iPSC细胞的情况。随后，该患者进展为高危MDS，并获得了C/EBPα bZIP结构域的杂合破坏。通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，在低危iPSC细胞中引入类似的C/EBPα bZIP结构域杂合破坏（通过在蛋白质中间区域引入移码突变，即CEBPAmut），重现了高危表型。这些同基因细胞系的血液学表型显示，低危细胞系存在明显的红细胞生成不良，且在疾病进展过程中加剧，模拟了患者中观察到的临床表型。CEBPAmut造血祖细胞（HPC）中C/EBPα bZIP结构域的破坏导致粒细胞分化受阻，分化偏向红系谱系，并使异常红细胞前体获得自我更新能力。这些变化伴随着对髓系分化和AML重要基因（如MAF、CEBPE、CELSR3和RUNX1）染色质的改变。此外，C/EBPα bZIP结构域的破坏还导致细胞组成的改变。最后，研究揭示，当通过CRISPR修复SRSF2和RUNX1突变时，高危iPSC细胞系中观察到的红系分化和自我更新能力被消除。因此，该研究确定了在SRSF2和RUNX1突变的背景下，bZIP结构域CEBPA突变作为疾病进展驱动因素的致病作用。
 

MDS的广泛异质性是由血液祖细胞在衰老过程中获得的不同突变组合所导致的，进而引发克隆进化和疾病进展。在患者中，剪接体成分和表观遗传修饰因子的突变也可作为驱动突变，当它们共同发生时，会产生导致MDS发生的组合。通过基于PCR和测序的研究，CEBPA突变也被证明与疾病进展和AML相关。然而，目前尚缺乏直接证据，因为这需要在同基因背景下系统地测试不同突变对MDS发病机制的贡献。已有报道从一名携带CEBPA突变（H24fs84）以及TET2、IDH2、ASXL1和SRSF2突变的AML患者中生成了iPSC。然而，从一名携带CEBPA突变F31fs130以及TET2、STAG2、SRSF2和CSF3R突变的AML患者中生成iPSC却未成功，也无法从疾病进展后携带破坏CEBPA bZIP结构域突变（Gly257fs）的患者中生成iPSC，这凸显了高危MDS和AML患者复杂的遗传背景决定了生成iPSC的能力。
 

在本研究中，应用体细胞重编程为iPSC和CRISPR技术，从一名疾病进展前后的代表性患者中生成了人类同基因MDS细胞系。通过使用CRISPR/Cas9破坏野生型（wt）和突变背景下的CEBPA bZIP结构域，并逆转SRSF2 P95H和RUNX1 G217P fs突变，能够剖析不同突变对疾病表型的贡献。这些实验确定了CEBPA bZIP结构域的破坏是该突变背景下疾病进展的致病因素，影响了从低危到高危演变过程中的细胞命运决定。此外还表明：（i）在野生型背景下，bZIP结构域的杂合破坏会阻碍粒细胞分化，但不会赋予自我更新能力；（ii）主要突变模式（SRFS2和RUNX1）会导致红系和髓系谱系的发育异常；（iii）额外引入导致bZIP结构域破坏的CEBPA突变会导致两者的结合，并促进HPC的自我更新能力，从而模拟了患者中观察到的AML发展风险增加的情况。
 

研究发现与大多数MDS患者的病理数据广泛一致，包括存在少量CFU祖细胞。在液体培养中，具有不同突变背景的细胞发生异常血细胞发育，揭示了具有异常形态的成熟细胞的发展，如核桥和多核内容物，这些都是MDS患者的常见发育异常特征。此外，还能够重现患者中对5-氮杂胞苷的治疗抵抗性。因此，MDS27-iPSCs模型是一个真实的体外模型，用于研究早期MDS疾病病理，显示了与患者诊断时和疾病进展后相似的红系和髓系发育异常，类似于患者的贫血和血细胞减少症。
 

该项研究还揭示了突变型C/EBPα及其与其他突变在MDS病理中的相互作用，当所有突变均为杂合状态时。同基因低危和高危克隆产生的HPC百分比相似。与C/EBPα在粒细胞祖细胞形成中的关键作用一致，在集落形成实验或液体培养中均未检测到CFU-G或成熟粒细胞。尽管如此，高危iPSC在甲基纤维素中具有形成CFU的潜力，且数量远高于之前报道的。已有报道指出，CEBPA敲除的胎儿肝脏祖细胞具有超增殖性，髓系分化失败，并在体内和体外显示出增加的自我更新潜力。此外，用C端突变的C/EBPα（CEBPACmut）转导的小鼠骨髓单核细胞在六轮重新铺板后增加了CFU形成集落的自我更新能力。此外，用这些CEBPACmut骨髓细胞处理过的5-氟尿嘧啶（5-FU）小鼠在移植到受体小鼠后发展为AML。然而，数据表明，在野生型背景下，CEBPA蛋白质中间区域的移码突变并未赋予自我更新能力。因此，获得CEBPA突变后自我更新能力的增加必须是由于与克隆内其他突变的协同作用。先前已有报道指出，RUNX1突变会增强自我更新能力并阻碍粒细胞分化。事实上，在高危iPSC中逆转SRSF2和RUNX1突变（携带CEBPA bZIP突变）消除了增强的自我更新能力，表明（i）突变的组合决定了表型，（ii）添加影响bZIP结构域的CEBPA突变会进一步阻碍RUNX1/SRSF2突变的粒细胞分化，（iii）促进红系祖细胞比例的增加而牺牲髓系祖细胞，以及（iv）赋予这些细胞自我更新能力。
 

尽管存在野生型等位基因，数据表明，蛋白质中间区域的移码突变导致的C/EBPα蛋白会影响染色质景观，通过远端顺式调控元件中可及染色质区域的失调来实现，这表明该蛋白具有主导性的去调控活性，可能是通过干扰二聚化实现的。丢失的染色质位点富含PU.1、KLF和CEBPA基序，表明C/EBPα结合丢失，这与突变蛋白质开放阅读框的改变一致。有趣的是，iPSC和患者HPC均仍能产生CD11b+细胞，这支持了先前关于小鼠胚胎中独立于PU.1的巨噬细胞能够生成组织巨噬细胞的报道。高危HPC获得了富含ETS和RUNX基序的ATAC-seq峰，这些基序已被报道可调节携带CEBPA双等位基因突变（CEBPAN/C）的AML患者的白血病特征，而GATA基序的富集则表明高危细胞的HPC分化程度低于低危细胞，这与髓系分化缺陷一致。在iPSC和患者疾病进展后的CD34+细胞中，相同的基序家族得到富集，这表明在获得CEBPA突变后染色质发生了共享的重构模式，从而强化了体外系统的有效性。
 

通过单细胞突变研究，已有报道指出在MDS疾病进展过程中克隆架构会发生变化，并且对来自两名从MDS进展为AML的患者的配对样本进行的单细胞转录组学研究揭示了与信号通路（如TGF-β和TNFα）相关的基因发生变化。衍生的携带MDS27患者遗传组成的同基因iPSC细胞系HPC能够通过单细胞RNA测序研究该患者疾病进展过程中由C/EBPα bZIP结构域杂合破坏所强加的克隆进化和转录变化的细节。在低危和高危样本之间观察到了MDS特异性簇的大小变化，并且先前与AML相关的基因（如ID1、CD93和CALCRL）被这些簇内的细胞激活，同时还有编码多种胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的基因。例如，与MDS早期阶段相关的IGFBP3由低危簇中的细胞表达，但不由高危簇中的细胞表达。此外，数据还显示了与MDS进展和AML相关的重要信号通路（如Wnt和TGFβ信号通路）相关基因的上调。单细胞RNA测序分析还揭示，C/EBPα bZIP结构域的破坏会影响细胞的细胞周期，导致G1期阻滞。
 

高危MDS CEBPA突变发生在疾病进展阶段，此时超过50%的患者对去甲基化药物无反应。同基因iPSC细胞系提供了一个真实的体外实验系统，可作为药物筛选的平台，并用于未来关于疾病发展和药物抵抗分子机制的研究。

参考文献：Almaghrabi, R., Alyahyawi, Y., Keane, P. et al. A heterozygous CEBPA mutation disrupting the bZIP domain in a RUNX1 and SRSF2 mutational background causes MDS disease progression. Nat Commun 16, 5489 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60192-8